高通量技术在农林领域的广泛应用大大地加速了农林研究的进程,通过基因芯片及测序等技术可以帮助科研工作者解决农林领域研究中的各类问题,如:性状相关变异筛选、群体进化与选择、转录后基因调控、微优乐娱乐群体结构多样性等等。

伯豪优乐娱乐可以为您提供多组学的农林研究解决方案,包括:基因组层面全基因组重测序、Affymetrix SNP芯片、Illumina SNP芯片;转录组层面mRNA测序、全转录组测序/lncRNA测序、circRNA测序、miRNA测序;微优乐娱乐层面16S rDNA/18S rDNA/ITS扩增子测序、宏基因组测序(元基因组测序)等。奉上此诚意之作,我们坚信伯豪优乐娱乐是您的不二选择!
  • 基因组层面农林研究定制化解决方案
  • 转录组层面农林研究大杀器
  • 微优乐娱乐研究技术开启农林研究新思路

随着高通量技术的迅猛发展,目前已有大量动植物物种的基因组被测序完成。这使得对这些物种进行全基因组重测序成为可能,甚至可以根据SNP信息设计基因芯片,以便做大量样本SNP分型。在通过高通量手段得到全基因组范围的变异信息后,主要有两方面用途:变异筛查和分子标记。(1)性状相关变异筛选:通过比较野生型和突变型,得到基因组差异信息,用以解释变异和性状的关系。这需要使用全基因组重测序的方法,得知每一个位点的遗传信息以便做比较;(2)分子标记:使用低深度重测序或SNP芯片,得到均匀覆盖在整个基因组上的变异位点。通过分子标记与性状位点之间的关联,将目标性状定位在某个分子标记附近。基于分子标记的研究方向主要有:遗传图谱构建与QTL定位、BSA测序定位、全基因组关联分析、群体进化和选择。实验平台包括高通量测序平台(Illumina Hiseq平台)和SNP芯片平台(Affymetrix GeneTitan®芯片平台和Illumina 光纤微珠芯片平台)。

一、技术平台
全基因组重测序

全基因组重测序是对已有参考基因组序列的个体或群体进行测序,通过与原有基因组进行比较,得出丰富的全基因组变异信息。随着测序成本的降低和分析技术的成熟,目前全基因组重测序在不同物种、不同研究领域均有广泛应用。

技术路线

样本要求

1. 样品纯度:OD 260/280值应在1.7~2.0 之间, A260/A230 > 1.5;RNA 应该去除干净;不含有其它个体或其它物种的DNA污染;
2. 样品浓度:浓度不低于55ng/μl;
3. 样品总量:每个样品总量不少于2μg;
4. 样品溶剂:溶解在TE或水中;
5. 样品运输: DNA低温运输,在运输过程中请用parafilm将管口密封好,以防出现污染。

SNP基因分型芯片

伯豪优乐娱乐拥有全面的高通量基因分型平台——Affymetrix GeneTitan®芯片平台和Illumina 光纤微珠芯片平台,以及专业的分析团队和高效的优乐娱乐信息服务器,为科研工作者提供全面的基因分型和优乐娱乐信息分析服务。

Affymetrix SNP基因分型芯片

美国 Affymetrix公司开发的寡核苷酸原位光刻合成专利技术(light-controlled in situ synthesis of DNA microarrays),是目前最高密度的芯片制备技术。GeneTitan®仪器以及业界公认的Affymetrix®高通量(HT)芯片板为芯片处理带来了第一个无需手动的自动化方案。Affymetrix GeneTitan®将杂交、洗涤和成像无缝整合到一台仪器中,具有以下优点:(1)扩展性。GeneTitan®平台可选择多样的芯片板形式,从而达到通量的扩展;(2)高效。手动操作时间仅30分钟,可无人值守;(3)灵活。通过多种芯片板完成不同的实验目的;(4)准确。实验条件的稳定可产生具有高度可重复性的数据。

Axiom®基因分型解决方案为您提供多种芯片。您可以选择要研究物种的自定义内容,也可以选择来自Axiom®基因组数据库的基因型经过验证的内容。

强大
对任何物种、任何基因组规模和任何倍性水平进行基因分型
Axiom®分析可检测插入或缺失(InDel)并保证包含所有候选SNP,与相邻SNP最近可达20 bp,实现了更高效的QTL分析

可靠
低至100 ng DNA,即可获得基因分型结果,适用于各种样本类型
基因型检出率 ≥ 99%

扩展
完全自动化的流程,每周可处理最多8张芯片板,而无需增加人工或仪器
一张芯片板上有96个或384个样本,检测每个样品多达260万个变异

实验流程

产品目录

芯片名称 物种 位点数 最少样本数
动物物种
Axiom® Equine Genotyping Array 671K 192
Axiom® Porcine Genotyping Array 659K 192
Axiom® Trout Genotyping Array 鳟鱼 58K 192
Axiom® Trout Genotyping Array 384-format 鳟鱼 58K 768
Axiom® Genome-Wide BOS 1 Array Plate Genotyping Bundle 1 640K 192
Axiom® Genome-Wide Chicken Genotyping Array 580K 192
Axiom® Buffalo Genotyping Array 水牛 90K 192
Axiom® Salmon Genotyping Array 三文鱼 130K 192
植物物种
Axiom® Soybean Genotyping Array 大豆 181K 192
Axiom® Cotton Genotyping Array 棉花 36K 192
Axiom® Wheat 820k Genotyping Array Plate A 小麦 820K 96
Axiom® Wheat 820k Genotyping Array Plate B 小麦 820K 96
Axiom® Wheat Breeder's Genotyping Array 小麦 35K 768
Axiom® Strawberry Genotyping Array 草莓 90K 192
Axiom® Maize Genotyping Array 玉米 600K 192
Axiom® Rose Genotyping Array 玫瑰 69K 192
Axiom® Rice Genotyping Array 水稻 43K 192
个性化定制
Axiom® myDesign TG Array 定制 1K-2.6M >480
注:更多物种相关芯片产品详询伯豪优乐娱乐。
Illumina SNP基因分型芯片

Illumina 公司以测序业务闻名,而其在优乐娱乐芯片方面的业务也具有不可忽视的优势和竞争力。Illumina SNP Genotyping采用激光共聚焦微珠芯片技术(BeadArray™),可对全基因组或特定SNP位点进行分型,其检测质量可靠,得到业界所广泛认可。

实验流程

第一天 第二天 第三天 ……
Infinium技术 gDNA NaOH变性
全基因组扩增过夜
扩增后DNA片段化
DNA片段沉淀和重悬
准备BeadChip DNA
片段上芯片杂交
芯片上进行单碱基延伸
芯片扫描
原始数据
数据分析

产品目录

芯片名称 物种 位点数 最少起订量
动植物*
Bovine HD BeadChip ~770K 48
Bovine LD Genotyping BeadChip ~8K 48
BovineSNP50 DNA Analysis BeadChip ~50K 48
Canine HD BeadChip ~170K 48
Ovine SNP50 BeadChip ~50K 48
Porcine SNP60 BeadChip ~60K 48
Maize LD BeadChip 玉米 ~3K 48
Maize SNP50 玉米 ~50K 48
个性化定制
iSelect HD Custom Genotyping BeadChips 定制 3k–90k 24
iSelect HTS Custom Genotyping BeadChips 定制 90k–700k 24

注*:更多动植物物种芯片产品请参见Illumina官方产品目录。

样本要求

1. 样品纯度:OD 260/280值应在1.7~2.0 之间, A260/A230 > 1.5;RNA 应该去除干净;不含有其它个体或其它物种的DNA污染;
2. 样品浓度:浓度不低于55ng/μl;
3. 样品总量:每个样品总量不少于2μg;
4. 样品溶剂:溶解在TE或水中;
5. 样品运输: DNA低温运输,在运输过程中请用parafilm将管口密封好,以防出现污染。

二、研究方向
性状相关变异筛选

当研究基因组差异较小的多个个体时(例如动物家系中的患病和正常个体,动植物群体中的突变型和野生型等),可直接对这些个体进行全基因组重测序,直接比较SNV、InDel、CNV或SV信息,得到个体之间的基因组差异。通过对这些差异进行筛选(例如致病位点的共分离,突变型比野生型多出的变异等),最终可以获得少量的性状相关变异位点进入后续验证,来确定性状相关的变异。

案例解析

案例一 全基因组测序定位狗足垫角质化隐性病遗传位点

此案例研究了一种称为足垫角质化的狗隐性遗传病,使用了患病狗和其亲本的核心家系(Trios)进行全基因组重测序,与狗的参考基因组进行比对,得到了大量的SNVs和InDels突变。接下来,通过ANNOVAR注释,进行致病位点筛选:

(1)筛选出可能导致蛋白功能变化的突变;
(2)符合携带者父母本为杂合,患病子代为纯合的突变;
(3)去除在狗的群体中为多态性的位点;
(4)选出蛋白功能预测为有害的突变;
(5)选出分型质量好的突变;
(6)经过一代测序验证的突变;
(7)在散发病例中扩大验证。最终,将致病位点相关变异锁定在 FAM83G 基因上的一个突变上。

原文出处:

Sayyab S, Viluma A, Bergvall K, et al. Whole-Genome Sequencing of a Canine Family Trio Reveals a FAM83G Variant Associated with Hereditary Footpad Hyperkeratosis. G3: Genes, Genomes, Genetics, 2016, 6(3): 521-527.

遗传图谱构建与QTL定位

遗传连锁图谱(Genetic linkage map)是以基因重组交换值为基础构建的遗传图谱,可表示分子遗传标记之间的相对位置和距离,常用于数量性状定位。数量性状(Quantitative characters)是指在一个群体内的各个体间表现为连续变异的性状,在一个群体内各个个体的差异一般呈连续的正态分布,难以在个体间明确地分组。大多数控制农艺性状的位点均为数量性状位点(quantitative trait locus,QTL)。QTL连锁定位以遗传图谱的构建为基础,将QTL定位在遗传图谱的一个区间内。

技术路线

案例解析

案例一 重测序构建芝麻超高密度图谱以及花序基因的定位

芝麻是重要的油籽作物,具有无限花序的特征,俗称“芝麻开花节节高”。但是,这样的性状使种子不同时间成熟,极不利于作物收集,影响农产品质量。在此前的 QTL 定位研究中,使用构建的芝麻遗传图谱远未达到饱和。本研究中,作者使用了全基因组重测序策略,对两种生长特征的亲本和其 F2 群体构建了超高密度SNP遗传图谱,平均标记密度约 0.98 cM/bin 或 0.1 cM/SNP ,图谱接近了饱和状态。随后,根据无限花序或有限花序的特征,在此图谱上进行 QTL 连锁定位,得到 LG8 染色体上 18.0 cM-19.2 cM 一段染色体区间。根据重测序数据对这一段区间进行突变位点检测,发现了位于 SiDt 基因上的功能性变异 G397A。

a. QTL区间位于LG8染色体;b. QTL区间内包含25个基因,14个候选SNP/InDels位点;c. 仅有SiDt基因的SNP与性状共分离,其中有一个功能相关变异G397A;d. PCR引物设计情况,用于其它品系突变检测。

原文出处:

Zhang H, Miao H, Li C, et al. Ultra-dense SNP genetic map construction and identification of SiDt gene controlling the determinate growth habit in Sesamum indicum L.[J]. Scientific Reports, 2016.

BSA测序定位

在动植物性状定位研究中,将家系后代中具有极端相反性状的个体分为两组,以此寻找与性状呈现共分离的分子标记,实现性状定位的方法,称为混合分组分析法(Bulked Segregant Analysis,BSA)。在高通量测序普及的近十年内,BSA方法再次成为了性状定位研究的有力工具。在众多方法中,以QTL-seq和MutMap最为常用。QTL-seq可用于应对自然发生的数量性状和质量性状;MutMap是一种特定的应用,分析寻找的是EMS诱变导致的突变性状,而非自然产生的突变。

技术路线

注:绿色框内为测序样本

案例解析

案例一MutMap方法快速培育耐盐水稻品系Kaijin

在日本的Ryohei Terauchi团队提出MutMap方法两年后,他们成功使用该方法在两年之内快速培育出了一个耐盐水稻品系Kaijin并成功推广。

a. SNP-index图,蓝色点为SNP-index数值,红色线为窗口(Sliding windows= 4Mb,步移10kb)SNP-index均值,橙色线为99%置信区间;b. OsRR22/HST1 基因结构,绿色框为Tos17插入突变位置;c. Sanger测序验证突变位点导致提前终止;d. Tos17插入突变验证 OsRR22 的功能,不耐和耐盐分离比为3:1。

研究使用了6,000株EMS诱变过的水稻品系Hitomebore,经过7天的1.5% NaCl条件培养,选择出耐盐突变品系hst1。经过与已有耐盐品系比较,发现hst1具有更强的耐盐性,适合作为优良品系育种的亲本。接下来,hst1与野生型Hitomebore进行杂交并构建F2群体,经过0.75% NaCl处理,发现不耐盐和耐盐分离比符合3:1的关系。将耐盐F2子代20株进行混池测序,并与野生型亲本进行比较,得到1,005个突变位点。对这些突变位点进行SNP-index的计算,统计出显著偏离0.5的点,发现2个SNP-index =1的位点,其中一个导致OsRR22基因的第三外显子发生提前终止,另一个位于非编码区。最后,作者使用了水稻Tos17突变体库的OsRR22突变株验证了该突变结果确实将导致水稻耐盐,并通过回交亲本和Sanger测序验证培育出耐盐品系Kaijin。此项工作证明了MutMap方法在育种领域的高效性。

原文出处:

Takagi H, Tamiru M, Abe A, et al. MutMap accelerates breeding of a salt-tolerant rice cultivar. Nat Biotechnol. 2015, 33(5):445-9.

案例二 使用QTL-seq快速定位水稻的数量性状

研究者使用了抗稻瘟病和易感稻瘟病品系杂交构建了RILs群体,并对直链淀粉低含量和高含量品系、稻苗低活力和高活力品系杂交构建了F2群体。随后,这些性状在RILs和F2群体中出现了性状分离,作者挑选了具有极端表型(极抗病/极易感病,极高/极低淀粉含量,以及极高/极低活力)的个体分别混为两个DNA池并进行建库,并进行全基因组重测序,通过群体间SNP频率的差异来进行基因定位。结果表明,QTL-seq与传统QTL连锁定位方法得到的QTLs位点相符。

在水稻RILs群体中用QTL-seq寻找抗稻瘟病位点。a. 抗稻瘟病品系Nortai和易感病品系Hitomebore在2周真菌处理后的情况;b. 对RILs不同个体抗病表型进行分级;c. 4和5级作为抗病组,8 – 10 级作为易感组进行混池;d. 绿色和黄色分别代表抗病和易感组,蓝色代表两者SNP频率差值;底部图为QTL连锁分析结果。

原文出处:

Takagi H, Abe A, Yoshida K, et al. QTL‐seq: rapid mapping of quantitative trait loci in rice by whole genome resequencing of DNA from two bulked populations. Plant Journal for Cell & Molecular Biology, 2013, 74(1):174–183.

全基因组关联分析

全基因组关联分析(genome-wide association studies,GWAS)是一种在全基因组水平上将大量样本的表型和基因型进行对照分析或相关性分析,从而对复杂性状进行基因定位的方法。目前,GWAS已经成为动植物数量性状位点(quantitative trait locus,QTL)精细定位的重要手段。随着越来越多的物种全基因组测序完成,GWAS将更广泛地应用于育种和进化领域。

技术路线

案例解析

案例一 使用 GWAS 研究鸡攻击行为相关基因

攻击行为是很多物种共有的进化属性,它可以帮助雄性物种快速建立生存空间或社会主导地位。本文使用 GWAS 方法来探究攻击行为背后的遗传因素。研究共使用了 265 只雄性家鸡,在出生第60天时开始测量攻击性状,共 4 个,分别为T1:在记录期间(16天)内打斗的次数;T2:每天打斗的次数(超过 4 次则被记录);T3:打斗的天数;T4:超过 4 次打斗的天数。基因分型工作由伯豪优乐娱乐完成,使用了 Affymetrix Axiom 平台的高密度芯片,型号为 600K Affymetrix Axiom HD chicken genotyping array,共生成了 599,898 个SNP位点。经过质控后,保留 468,020 个SNP用于 GWAS 分析。结果共得到 33 个显著位点,涉及 26 个基因。随后,作者对 26 个相关基因进行代谢通路分析,根据基因互作网络进一步得到9个基因,其中 SORCS2 基因与多个基因互作,可能具有重要功能。最后,研究在鸡成纤维细胞系 DF-1 中敲降了 SORCS2 基因的表达量,优乐到上下游基因表达量也随之降低。此结果显示 SORCS2 基因可能会影响多巴胺通路的表达,从而影响到鸡的攻击行为程度。

T1-T4 四个攻击行为性状的 Manhattan 图,蓝和红色线分别表示 P=4.6E-6 和 P=2.3E-7

原文出处:

Li ZH, Zheng M, Abdalla A, et al. Genome-wide association study of aggressive behavior in chicken. Sci Rep. 2016.

群体进化与选择

群体进化是基于群体遗传学方法研究不同群体之间的结构、多样性和演化规律的一门学科。随着高通量分型技术的发展,群体遗传学研究已从使用单一或少数分子标记,转为使用基于全基因组的分子标记,如使用SNP芯片、全基因组重测序和简化基因组测序等技术得到的SNP标记。群体进化主要讨论以下几方面问题:(1)群体间的进化关系,群体结构和遗传多样性;(2)群体间的选择信号,通过遗传分化和选择性清除分析,筛选受到选择的基因,用以解释品系的驯化机制或种群的环境适应性进化;(3)群体的历史动态变化,例如有效种群大小,基因流,群体分化时间等。

技术路线

案例解析

案例一 家犬在驯化过程中食性的进化

本研究使用了全基因组测序,显示了家犬驯化过程中食性相关基因受到了进化正向选择。研究采用了样本混池的策略,将来自世界各地不同品种的狼和家犬每 12 个样本混为一个 DNA 池,共5个混池(60个样本),分别使用 Illumina Hiseq 平台进行了深度为7×左右的全基因组重测序,并以家犬为参考基因组(CanFam 2.0)进行比对。随后,对这5个混池进行了杂合度Hp和遗传分化指数Fst的分析,并将两个分析得到的候选基因取交集。结果共得到 36 个基因区域共 122 个基因。接下来,对这些基因进行了富集分析,确定了四个主要的基因功能:神经系统发育、精子卵子识别、分子功能调节和消化功能。作者详细分析了消化功能相关的基因,发现淀粉代谢相关的 α-2B-淀粉酶、麦芽糖酶和钠-葡萄糖协同转运编码蛋白均存在正向选择。经过 RT-PCR 实验,证明了编码 α-2B-淀粉酶的 AMY2B 基因在家犬的基因组中相对于狼发生了拷贝数增加。本文提供了使用混池策略进行进化选择分析的成功案例。

左图:编码 α-2B-淀粉酶的AMY2B基因发生拷贝数增加;右图:编码麦芽糖酶的MGAM区域发现高遗传分化和低杂合度

原文出处:

Axelsson E, Al. E. The genomic signature of dog domestication reveals adaptation to a starch-rich diet. Nature, 2013, 495(7441):360-364.

植物mRNA测序

如果要对当今优乐娱乐学研究技术做一个统计,那么mRNA测序绝对可以算是应用频率最高的几个技术之一。基于Illumina HiSeq平台的mRNA测序能够快速获得基因表达谱;基于测定的序列可以同时对cSNP,可变剪接等转录本的序列及结构信息进行精确的分析;另外对于检测低丰度转录本和发现新转录本具有独特的优势。

技术路线

案例解析

案例一 Proline responding 1 基因在玉米细胞周期调控与蛋白质合成过程中的研究

上海大学生命科学学院、上海市能源作物育种及应用重点实验室的研究人员证实,玉米 Pro1 基因(ZmP5CS2)的突变造成了突变体细胞中脯氨酸(proline)合成受阻,从而导致proline积累的减少。突变体中proline的缺乏引起了相应的转运RNA(tRNApro AGG)空载形式(uncharged tRNApro AGG)的增多,激活了细胞中的GCN2激酶,该激酶通过磷酸化真核优乐娱乐翻译起始因子eIF2α从而抑制了细胞中蛋白合成的普遍抑制;另一方面,突变体中proline的缺乏也引起了细胞周期相关基因、DNA复制相关基因以及细胞增殖相关基因表达的下调,从而抑制了细胞周期从G1到S期的转换。这一成果2014年6月21日在线发表于 The Plant Cell 杂志上。

脯氨酸在细胞分裂以及蛋白合成过程中的调控模式图

原文出处:Wang G, Zhang JS, Wang GF, et al. Proline responding1 plays a critical role in regulating general protein synthesis and the cell cycle in maize. The Plant Cell. 2014.6(6), 2582.

案例二 吸水链霉菌5008(Streptomyces hygroscopicus 5008)高产量生产井岗霉素的研究

上海交通大学对吸水链霉菌5008(Streptomyces hygroscopicus 5008)高产量生产井岗霉素(Validamycin)的研究做出重要贡献。研究人员对吸水链霉菌的γ-丁内酯(GBL)合成基因 afsA 与丁内酯受体基因 arpA 分别进行敲除和过表达改造。通过伯豪优乐娱乐的Illumina Hiseq2500 mRNA测序服务对吸水链霉菌基因变化进行分析,从而开发得到了井岗霉素高产量的吸水链霉菌(产量比改造前增加55%),为吸水链霉菌生产井冈霉素的基因工程改造做出了重要贡献。

野生型5008 与 shbR1/R3 敲除株的转录组差异

原文出处:Tan GY, Peng Y, Lu C, et al. Engineering validamycin production by tandem deletion of γ-butyrolactone receptor genes in Streptomyces hygroscopicus 5008. Metab Eng. 2015, 28:74-81.

植物全转录组测序/lncRNA测序

转录组是特定物种,组织或细胞在特定生理状态下转录的所有RNA的集合,包括mRNA和ncRNA,其中lncRNA (long non-coding RNA, lncRNA)是一类长度超过200nt的ncRNA,通过多种方式在表观遗传,转录以及转录后水平发挥调控作用。全转录组测序在研究mRNA的同时,能够发现大量的lncRNA,并对其表达水平和转录本结构进行分析。当进一步开展lncRNA与mRNA的关联分析时,就可以深入研究lncRNA的调控网络。

技术路线

案例解析

案例一 植物lncRNA分子机制研究扛鼎之作——PRC2复合物在拟南芥发育中的作用

春化抑制因子FLOWERING LOCUS C (FLC)的沉默是春化发育过程中主要的影响因素之一。FLC的沉默受到了在进化上保守的Polycomb Repression Complex 2 (PRC2) 复合物调控的。长链非编码RNA(lncRNA)在哺乳动物研究中广泛参与了PRC2复合物的优乐娱乐学过程。拟南芥(Arabidopsis)中,一个名为COLDAIR的lncRNA通过结合PRC2的方式帮助PRC2维持在FLC染色体上的覆盖。COLDAIR来源于FLC第一个内含子,在冷胁迫后大约第20天的表达达到高峰,在FLC基因座沉默后表达量下降到冷胁迫前的水平。包括启动子来源在内,目前已经在哺乳动物中鉴定到了多个lncRNA与PRC2相关。冷胁迫早期,COLDAIR招募PRC2到FLC第一个内含子附近。随后,COLDWRAP帮助PRC2在FLC全基因座区域内广泛覆盖,导致H3K27me3在全基因座区域内出现。这个过程直到COLDAIR转录区域以及FLC启动子区域完整的染色体环形成为止。

COLDWRAP具体分子机制示意图

原文出处:Kim DH, Sung S. Vernalization-triggered intragenic chromatin loop formation by long noncoding RNAs. Dev Cell.2017.

案例二 CHIP-Seq+全转录组测序——玉米籽粒重要转录因子下游靶标的筛选与功能分析

我们需要从植物种子中获得什么?这不是一个类似遗失很久的苏斯博士的书,而是一个严肃的农林方向的问题。确实,人工选择使得谷物的表型产生了大量的变化,以至于种子更多的存在于茎上,而不是埋藏在地下。考虑到种子在我们的日常饮食过程中的重要作用,农艺学家以及优乐娱乐学家最近更多的开始关注于如何提高种子的营养价值。举例来说,玉米(Zea mays)种子主要包含了淀粉以及醇溶蛋白。醇溶蛋白是一类单子叶谷物类植物特有的营养储藏蛋白,分别由α-,β-,γ-和δ-类组成。根据生化分析,此类蛋白只含有微量的赖氨酸和色氨酸。

opaque2 (o2)突变体首先在1964年被人们在美国的一处农场中发现。o2 突变体中玉米籽粒胚乳发生剧烈的变化,其胚乳相较于野生型而言呈现粉质状,且不透明,并且醇溶蛋白(尤其是α类醇溶蛋白)含量显著下降,与此同时,非醇溶蛋白含量显著上升,导致突变体籽粒中赖氨酸含量比野生型高约70%。然而,O2作为一个籽粒发育过程中重要的转录因子其下游的靶标,却还不为人所知。在此,研究人员通过玉米籽粒全转录组测序实验以及ChIP-seq对O2下游靶标进行筛选。

研究人员通过RNA-Seq一共鉴定到了大约1000个差异基因以及lncRNA。对这些基因以及lncRNA的靶标进行功能归类后发现,差异基因与lncRNA主要富集在抗逆以及营养代谢途径。通过自制的O2抗体对O2进行ChIP-Seq实验结合全转录组测序结果发现,O2下游的调控因子包括醇溶蛋白,代谢酶以及转录因子等。

O2调控网络示意图

原文出处:Li, C., Qiao, Z., Qi, W., et al. Genome-wide characterization of cis-acting dna targets reveals the transcriptional regulatory framework of opaque2 in maize. Plant Cell, 2017,27(3), 532-45.

circRNA测序

环状RNA (Circular RNA, circRNA)是在转录过程中,通过可变剪接形成的一类首尾相连的环状RNA分子。高等优乐娱乐中,circRNA的种类和含量远远超过预期。最近的研究发现circRNA可以作为miRNA的海绵体,结合胞内miRNA,阻断miRNA对其靶标基因的抑制作用。circRNA也可与蛋白形成复合体调节下游的靶基因。另外,circRNA的表达呈现出很强的组织特异性,也暗示了circRNA也具有重要的优乐娱乐学功能。基于Illumina HiSeq平台的circRNA测序能够快速检测样本circRNA的种类并进行表达定量,结合优乐娱乐信息学挖掘手段,研究circRNA的功能和调控机制。

技术路线

案例解析

案例一 植物circRNA研究扛鼎之作:circRNA与其母基因mRNA形成R-loop调控母基因剪切

2017年4月17日,Nature出版集团的 Nature Plants 杂志在线以letters的形式在线发表了法国格勒诺布尔阿尔卑斯大学的最新研究成果,详细论证了来源于植物特有的MADS-box转录因子 SEPALLATA3(SEP3) 的circRNA对母基因mRNA的调控分子机制。研究人员发现,SEP3的第6个外显子形成的circRNA可以显著增加母基因跨越外显子的可变剪切(cognate exon-skipped AS variant,SEP3.3缺乏exon 6)程度,导致植物开花表型变化。并且研究人员发现,这个circRNA可以强烈结合其母基因的DNA基因座,形成一个RNA:DNA杂合体(R-loop)。R-loop的形成可以导致转录的中止,同时招募剪切因子引发对SEP3的可变剪切。这不仅是植物学研究中少数的circRNA分子机制研究的论文,同时也为人们对circRNA的认识提供了新的理解,首次将circRNA与个体器官的表型相结合。在植物学领域与医学领域都具有显著的优乐娱乐学意义。

circRNA被敲降后表型优乐

原文出处:Conn VM, Hugouvieux V, Nayak A, et al.A circRNA from SEPALLATA3 regulates splicing of its cognate mRNA through R-loop formation. Nat Plants. 2017,3, 17053.

miRNA测序

small RNA是指长度在18~30nt的内源性RNA,包括miRNA,siRNA和piRNA等。它们在mRNA的转录及转录后水平的调控中发挥重要作用,参与细胞生长、分化、代谢等各个优乐娱乐学过程,对优乐娱乐体的正常发育和疾病过程起着关键作用。Small RNA测序是指基于高通量测序平台对目标样本的small RNA进行大规模检测,同时发现新的小RNA,结合优乐娱乐信息学挖掘手段,研究small RNA的功能、结构和调控机制。

技术路线

案例解析

案例一 小尾寒羊和陶赛特羊脂肪组织RNA测序研究其形态差异

中国农业科学院对小尾寒羊和陶赛特羊脂肪组织中miRNA进行测序,对两种羊的形态特征差异进行研究。研究人员在两种羊脂肪组织中发现了3132个miRNA,其中54个miRNA在两种羊中的表达存在差异。对miRNA差异基因的GO与通路分析研究表明,小尾寒羊的脂肪组织脂类代谢弱于陶赛特羊。该研究极大地有助于人们增加对这两种羊的形态差异的认识。

差异miRNA散点图及qPCR验证结果

原文出处:Miao X, Luo Q, Qin X, et al.Genome-wide analysis of microRNAs identifies the lipid metabolism pathway to be a defining factor in adipose tissue from different sheep. Sci Rep .2015, 5:18470.

16S rDNA/18S rDNA/ITS扩增子测序

16S rDNA 扩增子测序:16S rDNA为原核优乐娱乐中编码核糖体小亚基rRNA的DNA序列,具有9个高变区域(V1-V9)和10个保守区域,其中保守区反映细菌种属间亲缘关系,高变区反映了物种间的特异性,选择通用引物进行PCR扩增,进而通过新一代测序技术对16S rDNA的单个或多个高变区进行测序,来分析环境或者临床样本中古菌或细菌的群落结构多样性。

18S rDNA扩增子测序:18S rDNA真核优乐娱乐中编码核糖体小亚基rRNA的DNA序列,具有可变区(V1-V9,没有V6区)和保守区。保守区反映优乐娱乐物种间的亲缘关系,高变区反映物种间的差异。选择通用引物进行PCR扩增,进而通过新一代测序技术对18S rDNA的高变区(一般选择V4区)进行测序,来分析环境或者临床样本中真核优乐娱乐群落结构多样性。

ITS扩增子测序:ITS分为两个区域:ITS1/ITS2,其中ITS1位于真核优乐娱乐核糖体rDNA序列18S和5.8S之间,ITS2位于真核优乐娱乐核糖体rDNA序列5.8S和28S之间。通过新一代测序技术对ITS1或者ITS2进行测序,进一步做环境微优乐娱乐中真菌多样性分析。

技术路线

案例解析

案例一 退化土壤中微优乐娱乐群落结构及功能的变化

土壤退化是一个及其严重的全球问题,长期连作和滥用化肥会造成土质变差。全球范围内,每年约有40%的农业土壤发生严重退化,24%的土壤仍在持续恶化。在中国,农业化肥的滥用导致土壤退化,造成土壤养分失衡、土壤酸化、污染物积累和优乐娱乐多样性下降等现象。但是关于土壤微优乐娱乐群落对土壤退化及生态系统功能的反馈机制仍知之甚少。本文通过16S/18S rDNA多样性测序和基因芯片的方法研究退化土壤中微优乐娱乐类群和功能基因的转变。研究发现了退化土壤微优乐娱乐群落组成和结构发生改变,同时土壤pH值和酶活性发生降低。此外,为了应对土壤酸化及其他不利环境因素,退化土壤的应激反应、毒力、硫代谢相关基因显著增多,不利于有益微优乐娱乐的生存。这些结果为我们更好地了解土壤微优乐娱乐群落对土壤退化及生态系统功能的反馈机制提供了新的方向。

左图:正常和退化土壤中微优乐娱乐丰度的比较。(a)细菌的比较结果(b)真菌的比较结果;右图:正常和退化土壤中微优乐娱乐组成与土壤物化指标的关系

原文出处:Zhang H, Wang R, Chen S, et al. Microbial taxa and functional genes shift in degraded soil with bacterial wilt. Sci Rep. 2017, 7.

宏基因组测序(元基因组测序)

宏基因组测序是对特定环境中的整个微优乐娱乐群落的基因组信息进行检测,进而研究生境中微优乐娱乐的群落结构、物种分类、进化关系、基因功能及微优乐娱乐与生境之间的相互作用关系的一项测序技术。

宏基因组测序不依赖传统的微优乐娱乐分离纯化技术,直接提取生境样本中的总DNA进行测序,为鉴定低丰度的微优乐娱乐群落和获得更多新基因等提供了新的途径。

技术路线

案例解析

案例一宏组学技术研究完整冻土,季节性解冻活跃层土壤和热岩溶沼泽中微优乐娱乐的组成与功能

地球大约有20%的面积是永久冻土,其中蕴含有大量的碳,一旦融化,这些蕴含在土壤中的碳就会被微优乐娱乐所转化,最终释放到大气层中。但是对土壤中活跃的微优乐娱乐的了解却很少。美国科学家通过宏基因组测序和宏转录组测序的方法研究完整冻土,季节性解冻活跃层和热岩溶沼泽中微优乐娱乐的组成,活跃程度以及潜在和活跃的功能。

物种组成及活性物种分析(a),16S rDNA,宏基因组(MG)和宏转录组(MT)分析物种组成(b)宏转录组和宏基因组的比值(MT/MG)分析, MT/MG>1,说明该物种在特定的样本中比较活跃。

原文出处:Hultman J, Waldrop M P, Mackelprang R, et al. Multi-omics of permafrost, active layer and thermokarst bog soil microbiomes. Nature, 2015, 521(7551): 208-212.