对遗传性疾病进行基因组编辑治疗,需要克服的最大挑战是安全和基因组编辑优乐娱乐大分子的有效传递。我们这个专题介绍在非病毒和病毒方法中,基因编辑优乐娱乐大分子的递送原理和选择依据。

▌基因编辑平台

锌指核酸酶(ZFN),转录激活因子样效应因子(TALE)核酸酶(TALEN)和CRISPR–CAS系统可诱导DNA的双链断裂(DSBs)。两种机制之一修复双链断裂实现基因组编辑:非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)。NHEJ通过插入或缺失破坏靶基因,而HDR将供体DNA模板插入目标基因组中,完成对基因组序列插入、缺失或改变。


图1 基因组编辑机制

想要将优乐娱乐大分子递送到细胞内进行基因组编辑,含有这些优乐娱乐大分子颗粒首先要避免细胞外的障碍。这些障碍包括被巨噬细胞吞噬细胞吞噬,或者是被酶降解或水解,以及诱导免疫反应和产生细胞因子的能力。

如果这些优乐娱乐大分子和纳米颗粒可以避免被身体排斥,能进入合适的器官或血液中,它们还必须进入靶细胞。一旦进入细胞,优乐娱乐大分子和纳米颗粒必须逃脱内涵体,定位于细胞质的mRNA或细胞核成功地编辑目标基因。


图2 递送基因编辑体系的障碍

▌常用基因编辑体系的递送方法

病毒还是非病毒

对基因编辑体系的递送方法一般可以归类为病毒(表1)或非病毒(图3,4)。病毒的方法利是用病毒载体(例如,AAVs,慢病毒与腺病毒)以RNA或DNA形式来包装体系,以促进有效的递送。非病毒递送的方法包括物理方法(例如电穿孔和基于微流控的技术),基于纳米材料的方法(例如,阳离子脂质体和细胞穿透肽(CPPS))以及自组装纳米粒子。


表1 用于基因编辑的三种主要类型病毒的特点

物理方法:可以不使用纳米粒子,对将进行基因组编辑的优乐娱乐大分子递送到细胞内。比如显通过体外微注射,体外直接注入胚胎或受精卵;或在体内进行流体动力学注射。另外,电穿孔或机械变形可以在细胞膜中产生短暂的孔隙,从而促进基因组编辑的优乐娱乐大分子进入细胞。


图3 用于基因组编辑优乐娱乐大分子递送的物理方法

递送基因组编辑优乐娱乐大分子的两类主要的非病毒纳米粒子是由阳离子材料制成的:脂类(图4中A部分)和聚合物(图4中B部分)。这样的纳米粒子和带负电荷的核酸或核糖核蛋白复合物络合和封装。图中可电离的脂质C12-200和8-O14b111已制成脂质纳米粒包装Cas9编码mRNA或核糖核蛋白复合物。此外,基因组编辑优乐娱乐大分子还可以被封装成壳聚糖修饰的PLGA纳米粒和PEI自组装DNA纳米颗粒,被称为“DNA nanoclews”。


图4 对基因组编辑优乐娱乐大分子的非病毒纳米颗粒输送

体内还是体外

对于某些组织,基因组编辑系统可以在体外递送:通过从病人提取原代细胞,基因编辑这些细胞然后移植,让改性的细胞回到病人体内。一个潜在的靶组织是造血系统。体外递送可以使用无法系统实施的物理方法。比如质粒的体外电穿孔能提高相对高的转染效率。逆转录病毒和慢病毒载体也可以在体外递送使用,能在造血干细胞或初级淋巴细胞稳定表达基因。

相对于体外治疗的递送,体内基因组编辑面临额外的障碍,对于病毒和非病毒体系是不同的。

病毒系统向各种组织(包括肝脏、眼睛、骨骼、肌肉和心脏)递送遗传遗传物质的能力和有效性已经进行了研究。病毒系统的广泛适应性对于递送可编程的核酸酶很有吸引力。这些病毒系统一次注射就可以诱导人类长期的转基因表达。因此,转基因核酸酶长期表达对基因组稳定性和组织中抗原性的影响,都需要进一步调查。

脂质基和聚合物基纳米颗粒共轭技术可以促进RNA在体内递送,并能在临床的各个阶段进行。这些非病毒平台也可用于提供可编程的核酸酶,使其瞬间在目标组织表达。

鉴于体内和体外给药途径所面临的不同挑战,方法及最佳操作程序将有所不同。然而, 大多数组织治疗用途的基因组编辑不能在体外执行。有效的体内递送将是必需的。

▌基因传递载体的选择依据

质粒编码的基因组编辑相关蛋白必须成功转染到细胞的核里面,转录它们的基因,并最终被翻译。细胞和核膜都是需要进入的物理壁垒;大的、如DNA、RNA和蛋白质这些亲水性分子不能有效地通过这些疏水性膜。此外,体内环境提出了更多复杂的核酸递送要求:裸露的核酸会受血液中的内源性核酸酶降解,可能作为一个外来核酸激活免疫系统,所以最好只转染靶细胞。由于这些原因,通常用递送载体来保护核酸或蛋白质货物,封装后针对特定的细胞和跨膜屏障有效载荷穿梭。

病毒载体

逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒(AAV),这三大类病毒,已经在提供遗传物质的治疗方面进行了广泛的应用。

逆转录病毒载体的特点是通过逆转录复制,例如,慢病毒载体,逆转录病毒载体的一个子类,可以将病毒DNA整合到不进行细胞分裂的细胞中,如神经元或肌肉细胞。

腺病毒载体只传递病毒双链DNA,而不是将其并入宿主细胞基因组中,使其适用于需要瞬时蛋白表达的应用。AAV载体是小的、简单的,游离的病毒能够转导分裂细胞和非分裂细胞。

在临床试验中,一些病毒载体已经证明有效的基因传递,但病毒基因治疗的历史也存在着严重的安全问题。AAV是非致病性,有望但在人类成为安全的基因载体,其长期影响表达的耐久性需要进一步调查。

非病毒载体

基于非病毒材料的递送载体比病毒载体具有更小的毒性和免疫原性,但也存在着一系列的递送方面问题的挑战。带负电荷的DNA和其它核酸可以被阳离子材料静电络合形成纳米颗粒,随后可被通过各种机制(包括受体介导的内吞作用和吞噬作用)的细胞吞噬。

迄今为止用于核酸传递的阳离子材料类中,最成功的是天然发生的和合成的聚合物(例如聚乙烯亚胺、环糊精和聚β氨基酯)和脂类(例如脂质体,设计好的脂质和脂质类似物)。

理想情况下,任何非病毒递送材料用于基因组编辑都应具有良好的耐受性(优乐娱乐相容性,非免疫原性),并且能够向细胞核递送有效载荷。

物理递送(无载体递送)

在某些情况下,基因组编辑不需要递送载体。

在体外治疗中,机械变形或电穿孔可以在细胞膜上产生短暂的孔,使核酸和蛋白质进入细胞

用于体内治疗的话,高浓度的、裸核酸的尾静脉水动力注射能有效地转染小鼠肝细胞,但有可能导致致命的急性副作用,在人类中很少采取直接注射。

核酸也可以直接注入胚胎或受精卵,但人类胚胎的基因组编辑仍然备受争议。

在这些局限性,临床上可用于基因组编辑体内治疗可能还是需要一个载体。

▌临床研究进展

一些正在进行的临床试验正在评估ZFN靶向单基因和传染性疾病的效果,比如修饰CCR5(HIV-1入侵机体细胞的主要辅助受体之一)来抵抗艾滋病。具体内容见下表。


表2 基因编辑的临床进展

美国CRISPR 治疗的领跑者Intellia Therapeutics、 Editas Medicin和CRISPR Therapeutics正在将CRISPR–Cas9技术用于人类的治疗。Intellia Therapeutics正使用脂质的纳米颗粒对比如TTR淀粉样变、α1-抗胰蛋白酶缺乏乙型肝炎病毒与先天性代谢缺陷的肝病进行体内治疗的探索。Intellia Therapeutics正用电穿孔介导也开发体外造血干细胞的CAR T治疗计划。同时Editas Medicine也在积极实施通过AAV在眼睛局部递送的基因编辑疗法的开发。CRISPR Therapeutics也正在评估CRISPR–Cas9的体内和体外治疗效果,其中包含体外靶向血红蛋白病、免疫缺陷以及靶向眼、肝、肺和其它器官的体内治疗。